УФ-поглощение белков: в главной роли триптофан, закон Бугера — Ламберта — Бера и многое другое

Как и все молекулы, триптофан состоит из атомов (отдельных атомов углерода, водорода и т. д.). Атомы соединяются, разделяя пары электронов — для одинарной связи нужно 2 электрона, а для одной из более коротких и прочных двойных связей — 4. Но что, если электронов недостаточно? Возможно, вам захочется присоединиться к электронному сообществу! (иначе известному как резонанс/делокализация электронов/сопряжение). Триптофан — сторонник этого. Триптофан — ароматический. Это не значит, что он приятно пахнет, это просто означает, что у него есть кольца, и в этих кольцах, после того как атомы «потратили» по одному электрону на связи со своими соседями, они отдают свой «лишний» электрон в общий запас. Атомы, которые присоединяются к этому сообществу, делятся электронами, и это приводит к делокализации электронов над и под ароматическими кольцами, как в пончике. Подробнее здесь: http://bit.ly/tryptophanfan А благодаря ароматичности он «видим» в «невидимом» диапазоне. Спектроскопия использует свет для измерения веществ, используя тенденцию различных молекул поглощать определенные длины волн света в разной степени (например, белки сильно поглощают свет на одной длине волны, а ДНК — на другой). Таким образом, если вы пропускаете свет через раствор, а затем смотрите, какой свет проходит через него, вы можете сделать выводы о том, что содержалось в этом растворе. Чем больше света «пропускают», тем больше его поглощается, и, следовательно, тем больше этой молекулы присутствует. Это очень удобно. Например, у нас есть УФ-детектор, который отслеживает, что выходит из колонок для очистки белков, так что вы можете определить, где именно выходит ваш белок. И мы часто используем спектрофотометр NanoDrop для измерения концентрации таких молекул, как нуклеиновые кислоты. Помимо концентрации, много информации о чистоте можно получить, посмотрев, где они не должны поглощать много света. Высота пика, на котором обычно фокусируются для конкретной молекулы, показывает, где она поглощает свет наилучшим образом — это соответствует количеству вещества (концентрации), тогда как соотношение между пиками может рассказать о чистоте этого вещества. Но как всё это работает на самом деле? И какова роль триптофана (Trp)? Свет (электромагнитное излучение) — это небольшие пакеты энергии, распространяющиеся волнами. Разные цвета имеют разные длины волн света с разной энергией. Разные молекулы поглощают разные длины волн света в разной степени, и это можно количественно оценить с помощью числа, называемого коэффициентом поглощения (ε), которое показывает, насколько хорошо молекула поглощает свет определенной длины волны. Подробнее о том, почему это так: http://bit.ly/2CfaXbJ Затем вы можете использовать это уравнение, называемое законом Бера, чтобы определить, сколько белка, ДНК или чего-либо еще поглощает на его основе. Вкратце, это связано с тем, сколько энергии имеют внешние электроны молекулы и сколько еще энергии им нужно, чтобы перейти на следующий уровень — электроны можно рассматривать как обитателей «домиков», называемых молекулярными орбиталями — это не значит, что они «всегда» находятся в одном месте — они постоянно перемещаются, но именно в этих орбиталях у вас наибольшие шансы их найти. Орбитали, расположенные дальше от ядер молекул (где находятся положительные протоны и нейтральные нейтроны), требуют от электронов большей энергии для существования там. Если молекула подвергается воздействию фотона оптимальной энергии, фотон может быть поглощен, и его энергия может быть использована для перехода электрона с более низкой энергией на орбиталь с более высокой энергией, расположенную дальше от ядра. ⠀ ⠀ Делокализация электронов посредством резонанса включает в себя слияние орбит некоторых соседних молекул (в случае ароматических колец они сливаются в это общее кольцо). Это снижает затраты на перемещение электрона. ⠀ ⠀ Все белки поглощают некоторое количество УФ-излучения. Пик поглощения белков приходится на 280 и 230 нм. Поглощение на 230 нм происходит за счет основной части молекулы — это соответствует поглощению пептидными связями, соединяющими молекулы (они тоже обладают некоторым резонансом, помните?). Части белков, поглощающие на 280 нм, — это ароматические кольца (звучит знакомо?). Только 3 из 20 распространенных аминокислот имеют такие кольца, и разные белки имеют разное количество этих 3 аминокислот. Поэтому разные белки по-разному поглощают свет на 280 нм, что отражается в разных коэффициентах экстинкции. ⠀ ⠀ Поскольку триптофан является основным поглотителем на 280 нм, поглощение УФ-излучения на 280 нм для каждого белка будет зависеть главным образом от количества триптофана в этом белке. Аномальные значения триптофана могут ввести в заблуждение! Слишком большое количество может привести к недооценке концентрации белка, а слишком малое — к переоценке, если ориентироваться на «среднее значение». Но если известна последовательность белка, можно рассчитать «оценочный коэффициент поглощения» для конкретного белка, использ...